广东医学教育网指出，探讨齿阿米素对大鼠心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）的保护作用及其机制。方法将60只大鼠随机分为假手术组、模型组、复方丹参片组（阳性药组，200mg·kg-1）及齿阿米素高、中、低剂量组（4、2、1mg·kg-1），每组10只。大鼠灌胃给药，每日1次，连续7d。末次给药后24h，采用左冠状动脉前降支结扎法建立MI/RI大鼠模型。造模2h后，记录各组大鼠的左室舒张末期内压（LVEDP）、左室收缩内压（LVSP）、左室内压最大上升/下降速率（LV±dp/dtmax）及平均动脉压（MABP）；测定大鼠血清乳酸脱氢酶（LDH）、C反应蛋白（CRP）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）含量及大鼠心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）及总抗氧化能力（T-AOC）水平；采用HE染色法观察大鼠心肌组织病理学形态变化；RT-PCR法检测大鼠心肌组织核转录因子-κB(NF-κB)、NF-κB抑制蛋白α（IκBα）及IκB激酶β（IKKβ）mRNA的表达水平；WesternBlot法检测大鼠心肌组织p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、IKKβ及p-IKKβ蛋白的表达水平。结果与假手术组比较，模型组大鼠心脏的LVEDP明显升高（P<0.01）,LV±dp/dtmax、LVSP及MABP明显下降（P<0.01）；血清中的LDH、CRP、CK及CK-MB活性明显增加（P<0.01）；心肌组织纤维排列紊乱，有核固缩、溶解现象，有炎性细胞浸润；心肌组织的SOD、GSH-Px及T-AOC水平显著降低（P<0.01）,MDA含量显著增加（P<0.01）；心肌组织的NF-κB、IKKβmRNA表达水平显著上调（P<0.01）,IκBαmRNA表达水平显著下调（P<0.01）；心肌组织的p-p65、p-IKKβ蛋白表达水平显著上调（P<0.01）,p-IκBα蛋白表达水平显著下调（P<0.01）。与模型组比较，齿阿米素高、中剂量组大鼠心脏的LVEDP明显降低（P<0.01）,LV±dp/dtmax、LVSP及MABP明显升高（P<0.05,P<0.01）;LDH、CRP、CK及CK-MB活性明显下降（P<0.01）；心肌组织病理损伤明显改善；心肌组织SOD、GSH-Px及T-AOC水平明显升高（P<0.05,P<0.01）,MDA含量明显降低（P<0.05,P<0.01）；心肌组织NF-κB、IKKβmRNA表达水平明显下调（P<0.01）,IκBαmRNA表达水平明显上调（P<0.01）；心肌组织p-p65、p-IKKβ蛋白表达水平明显下调（P<0.01）,p-IκBα蛋白表达水平明显上调（P<0.01）。结论齿阿米素对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用，其作用机制与抗氧化应激和抑制NF-κB信号通路有关。
心肌缺血是临床上常见的因心肌供血绝对或相对不足所导致的心血管疾病，表现为心前区疼痛、心悸、气短，甚至出现心肌坏死，若救治不及时，致残率、死亡率极高。目前，对于心肌缺血主要采取扩管、溶栓等恢复心脏血供的救治措施，但由于治疗过程中出现的缺血再灌注损伤，严重影响了治疗效果。因此，有效防止和缓解心肌缺血再灌注损伤（Myocardialischemiaandreperfusioninjury,MI/RI），是提高心肌缺血救治效率亟需解决的问题。研究表明，MI/RI与炎症、凋亡、细胞自噬、钙超载及过氧化应激等因素密切相关。齿阿米素（Visnagin）又称甲氧呋豆素、阿密茴素等，为伞形科植物阿米芹（AmmivisngaaL.）和毛茛科植物兴安升麻[Cimicifugadahurica(Turz.)Maxim.]等中草药植物的根茎提取物，具有抗痉挛、抗凝血、扩张血管、抑制阿霉素引起的心脏毒性，以及抑制黑色素瘤细胞增殖等药理作用。本研究拟建立MI/RI大鼠模型，观察齿阿米素对大鼠MI/RI的保护作用，并探讨其对氧化应激和核转录因子-κB(NF-κB）信号通路的影响。
1材料与方法
1.1动物
健康雄性SD大鼠60只，9～10周龄，清洁级，体质量220～250g，由成都达硕实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（川）2015-030。饲养条件：室温为22～25℃，湿度为55%～65%,12h/12h光暗循环，自由摄食饮水，适应性饲养1周后进行实验。
1.2药物
齿阿米素（纯度≥98%），批号：wkq-06947，购自四川省维克奇生物科技有限公司，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制为混悬液。复方丹参片，规格：每片0.32g，批号：E5A024，由广州白云山和记黄埔中药有限公司提供，临用前研磨为粉末，用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制为混悬液。戊巴比妥钠，批号：SIGMA-P3761，购自美国Sigma-Aldrich公司，临用前用生理盐水配制。
1.3试剂
乳酸脱氢酶（LDH，批号：20190316）、C反应蛋白（CRP，批号：20181205）、肌酸激酶（CK，批号：20190412）、肌酸激酶同工酶（CK-MB，批号：20190125）、超氧化物歧化酶（SOD，批号：20190328）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，批号：20181115）、丙二醛（MDA，批号：20190502）、总抗氧化能力（T-AOC，批号：20190425）检测试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：20190518）、NP-40蛋白裂解液（批号：20190107）、彩色预染蛋白Marker（批号：20190113）、SDS凝胶套装（批号：20190318）、超敏ECL显色液（批号：20190519），均购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗p65（批号：20190506）、p-p65（批号：20190610）、NF-κB抑制蛋白α（IκBα，批号：20190525）、p-IκBα（批号：20190602）、IκB激酶β（IKKβ，批号：20190615）、p-IKKβ（批号：20190320）、β-actin（批号：20190318）一抗及HRP标记的羊抗兔IgG(H+L）二抗（批号：20190110），均由美国AffinityBiosciences公司提供；TriQuickReagent总RNA提取试剂盒（批号：20190120）、逆转录试剂盒（批号：20190115）及琼脂糖（批号：20190220），均购自北京索莱宝科技有限公司；RT-PCR实验所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。
1.4主要仪器
BL-420F型生物机能实验系统、HX-300S型动物呼吸机，成都泰盟科技有限公司；UV759型紫外可见分光光度计，上海高致精密仪器有限公司；FA2204B型电子分析天平，上海精科天平厂；凝胶成像分析系统、水平电泳仪、垂直电泳仪及PCR仪，均为美国Bio-Rad公司产品；BX43型显微镜，奥林巴斯（中国）有限公司。
1.5分组、给药及模型复制
将60只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、复方丹参片组（阳性药组，200mg·kg-1）及齿阿米素高、中、低剂量组（4、2、1mg·kg-1)[12]，每组10只。按照上述剂量灌胃给药，每天1次，连续7d；假手术组和模型组大鼠灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液10mL·kg-1。
末次给药后，大鼠禁食不禁水24h，采用左冠状动脉前降支结扎法建立MI/RI大鼠模型[13]。具体操作如下：用4.0%戊巴比妥钠（1mL·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于手术板上，剪去颈部和胸部被毛，并用碘伏消毒处理。于大鼠颈部正中纵切，分离气管，并与小动物呼吸机连接建立人工通气；然后分离右侧颈总动脉，并插管至左心室，连接BL-420F型生物机能实验系统。记录大鼠左室舒张末期内压（LVEDP）、左室收缩内压（LVSP）、左室内压最大上升/下降速率（LV±dp/dtmax）及平均动脉压（MABP）。待大鼠血压记录平稳后，在左胸部搏动明显处逐层打开胸腔和心包膜，轻轻将心脏抬起，于左冠状动脉前降支下穿线并结扎；30min后将结扎线剪断，再灌注2h；记录大鼠再灌注后的血流动力学参数。假手术组大鼠进行气管插管、血流动力学测定等操作，左冠状动脉进行分离、穿线，但不进行结扎和再灌注。实验结束后，取大鼠静脉血分离血清待测；然后迅速摘取心脏，用生理盐水冲洗干净后，-80℃冻存备用。
1.6大鼠血清生化指标检测
完全按照试剂盒说明书步骤操作，测定大鼠血清LDH、CRP、CK及CK-MB的活性变化。
1.7大鼠心肌组织病理学观察
取大鼠左心尖组织约5mm×5mm×5mm，用生理盐水冲洗干净后，迅速置于10%福尔马林溶液中固定48h；依次进行梯度乙醇脱水、浸蜡包埋、切片、HE染色及封片等步骤；于光学显微镜下观察大鼠心肌组织病理学形态变化。
1.8大鼠心肌组织氧化应激指标测定
取大鼠心肌组织约100mg，用生理盐水制成10%组织匀浆，完全按照试剂盒说明书步骤操作，测定SOD、GSH-Px、MDA及T-AOC的水平变化。
1.9RT-PCR法检测大鼠心肌组织NF-κB、IκBα及IKKβmRNA的表达
取大鼠冻存心肌组织约100mg，用无菌生理盐水冲洗干净；迅速置入用0.1%DEPC溶液和高温处理过的研钵中，加入液氮并快速研磨至粉末状；然后加入1.5mLRNA提取试剂，按照说明书步骤提取总RNA，并转录为cDNA，加入引物进行PCR扩增反应。PCR反应条件：94℃5min;94℃35s,58℃40s,72℃35s,35个循环；72℃反应15min。取各待测基因扩增产物，于2.0%琼脂糖凝胶进行水平电泳；以β-actin条带光密度值为内参，分析各目的基因的相对表达水平。引物序列。
1.10WesternBlot法检测大鼠心肌组织p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、IKKβ、p-IKKβ蛋白的表达取大鼠心肌组织约100mg，剪碎后置入盛有2.0mLRIPA蛋白裂解液（含磷酸酶抑制剂）的匀浆器中充分匀浆；于冰上静置60min，使其充分裂解。将裂解后的组织匀浆转移至1.5mL的离心管中，以4℃、12000r·min-1（离心半径40cm）离心15min；取上清，采用BCA法测定各样本蛋白浓度，并调整至一致；加入等体积蛋白上样缓冲液，煮沸5min使其变性。取10μL蛋白样品上样，依次进行SDS凝胶电泳、转膜、抗原封闭、一抗孵育、二抗孵育等步骤。最后，采用ECL显色液显色，于凝胶成像仪下显影、拍照；以β-actin蛋白条带灰度值为内参，采用QuantityOne软件分析目的蛋白的相对表达水平。
1.11统计学处理方法
采用SPSS18.0统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两比较采用LSD检验；以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1齿阿米素对MI/RI大鼠心脏LVEDP、LVSP、LV±dp/dtmax及MABP的影响
与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠心脏的LVEDP明显升高，LV±dp/dtmax、LVSP及MABP明显下降，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，复方丹参片组和齿阿米素高、中剂量组大鼠心脏的LVEDP明显降低，LV±dp/dtmax、LVSP及MABP明显升高（P<,P<）。
齿阿米素对MI/RI大鼠心脏LVEDP、LVSP、LV±dp/dtmax及MABP的影响
2.2齿阿米素对MI/RI大鼠血清LDH、CRP、CK及CK-MB活性的影响
与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠血清中的LDH、CRP、CK及CK-MB活性明显增加（P<0.01）。与模型组比较，复方丹参片组和齿阿米素高剂量组大鼠血清中的LDH活性明显下降（P<0.01）；复方丹参片组和齿阿米素高、中剂量组大鼠血清中的CRP、CK及CK-MB活性明显降低（P<0.01）。
齿阿米素对MI/RI大鼠血清LDH、CRP、CK及CK-MB活性的影响
2.3齿阿米素对MI/RI大鼠心肌组织病理学形态的影响
假手术组大鼠心肌组织纤维排列整齐，结构完整，心肌细胞结构清晰，胞核染色均匀；MI/RI模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，有部分断裂，可见大量细胞结构缺损，有核固缩、溶解现象，有炎性细胞浸润。与模型组比较，复方丹参片组和齿阿米素高、中剂量组大鼠心肌组织损伤有明显改善，细胞结构较为完整，偶见心肌纤维肿胀、萎缩或部分断裂。
2.4齿阿米素对MI/RI大鼠心肌组织SOD、GSH-Px、MDA及T-AOC水平的影响
与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠心肌组织的SOD、GSH-Px及T-AOC水平显著降低，MDA含量显著增加，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，复方丹参片组和齿阿米素中、高剂量组大鼠心肌组织的SOD、GSH-Px及T-AOC水平明显升高，MDA含量明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。
齿阿米素对MI/RI大鼠心肌组织病理学形态的影响（HE染色，×200)
Figure1EffectofvisnaginonmyocardialhistomorphologyinMI/RIrats(HEstaining，×200)
齿阿米素对MI/RI大鼠心肌组织SOD、MDA、GSH-Px及T-AOC水平的影响
2.5齿阿米素对MI/RI大鼠心肌组织NF-κB、IKKβ、IκBαmRNA表达水平的影响
与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠心肌组织的NF-κB、IKKβmRNA表达水平显著上调，IκBαmRNA表达水平显著下调，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，复方丹参片组和齿阿米素各剂量组大鼠心肌组织的NF-κB、IKKβmRNA表达水平均明显下调，IκBαmRNA表达水平明显上调，差异均有统计学意义（P<0.01）。
齿阿米素对MI/RI大鼠心肌组织NF-κB、IκBα、IKKβmRNA表达水平的影响
齿阿米素对MI/RI大鼠心肌组织NF-κB、IKKβ、IκBαmRNA表达水平的影响
2.6齿阿米素对MI/RI大鼠心肌组织p65、p-p65、IKKβ、p-IKKβ、IκBα及p-IκBα蛋白表达水平的影响结果见图3、表6。与假手术组比较，MI/RI模型组大鼠心肌组织的p-p65、p-IKKβ蛋白表达水平显著上调，p-IκBα蛋白表达水平显著下调，差异均有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，复方丹参片组与齿阿米素中、高剂量组大鼠心肌组织的pp65、p-IKKβ蛋白表达水平明显下调，p-IκBα蛋白表达水平明显上调，差异均有统计学意义（P<0.01）。
3讨论
心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）是临床上心脏缺血性疾病救治过程中出现的常见病理性损伤，可加重心肌缺血缺氧损伤，诱发心肌细胞坏死，进一步造成心功能恶化。LDH、CRP、CK及CK-MB等血液生化指标是临床上判断心肌缺血损伤的重要参数，心脏LVEDP、LVSP、LV±dp/dtmax及MABP等血流动力学参数是评价心脏功能的重要指标。齿阿米素为阿米芹和兴安升麻等中药植物的根茎提取物，这2种中药均具有抗炎、舒张血管等作用。本研究发现，齿阿米素可显著改善MI/RI大鼠心脏血流动力学，降低大鼠血清LDH、CRP、CK及CK-MB等指标水平，明显缓解心肌组织病理损伤。结果提示，齿阿米素对MI/RI模型大鼠具有保护作用。
研究表明，氧化应激、炎性反应等病理因素是诱发MI/RI的主要原因。在MI/RI的病理过程中，由于缺血缺氧导致过氧化应激反应，使活性氧的产生多于消除，大量氧自由基集聚于细胞膜，产生脂质过氧化反应，破坏细胞膜结构的完整性，加剧了缺血心肌细胞的病理性损伤。因此，抑制过氧化应激反应是缓解和防治MI/RI的主要措施之一。SOD、GSH-Px是体内清除自由基的主要酶系，而T-AOC是反映机体抗氧化能力的重要指标之一，MDA是具有细胞毒性的过氧化反应的终产物，检测上述指标可初步判断细胞过氧化应激反应的损伤程度。
NF-κB信号通路与炎性反应密切相关，生理状态下，NF-κB以无活性的p50/p65/IκB聚合体形式存在于胞质中。MI/RI不断促进氧自由基的生成，刺激心肌组织持续释放炎症介质，激活IKKβ，使其发生磷酸化；p-IKKβ与p50/p65/IκB聚合体结合，使IκBα发生磷酸化和泛素化，诱发p50/p65/IκB聚合体解聚，p65发生磷酸化激活或游离；游离的p65能够迅速通过核膜进入细胞核，与DNA上其相应的靶因子（如TNF-α、IL-1β等炎症因子）作用元件结合，启动靶基因的转录，使炎症因子生成不断增多，产生瀑布式炎症级联反应，加重心肌组织的病理性损伤。
齿阿米素对MI/RI大鼠心肌组织p65、p-p65、IKKβ、p-IKKβ、IκBα、p-IκBα蛋白表达水平的影响
本研究结果发现，齿阿米素可以提高MI/RI模型大鼠心肌组织的SOD、GSH-Px及T-AOC水平，降低MDA含量；下调心肌组织NF-κB、IKKβmRNA表达水平，上调IκBαmRNA表达水平；下调心肌组织p-p65、p-IKKβ蛋白表达水平，上调p-IκBα蛋白表达水平。结果表明，齿阿米素对大鼠MI/RI的保护作用与其抗氧化应激和抑制NF-κB信号通路有关。
来源：广东医学教育网