探究产黑普氏菌（Prevotellamelaninogenica,P.m）作用下原代人口腔角质细胞（primaryhumanoralkeratinocytes,pHOK）的转录组变化，并在人口腔角质形成细胞（humanoralkeratinocyte,HOK）细胞系中进行验证。方法分离培养pHOK，并与P.m共培养4h与24h，提取总RNA，构建基因文库，转录组测序，分析差异表达基因，并进行基因本体论（geneontology,GO）通路分析与京都基因与基因组百科全书（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG）通路分析，在HOK与P.m共培养模型中采用qRT-PCR及WesternBlot对差异基因进行验证。结果在pHOK与P.m共培养4h组与对照组间上调表达的差异基因有：淋巴细胞胞浆蛋白1(lymphocytecytosolicprotein1,LCP1)、角蛋白7(keratin7,KRT7)、纤毛和鞭毛相关蛋白251(ciliaandflagellaassociatedprotein251,CFAP251)等，下调表达的差异基因有：含FERM、RhoGEF和Pleckstrin结构域蛋白1(FERM,ARH/RhoGEFandPleckstrindomainprotein1,FARP1)、WW结构域转录调控因子1(WWdomaincontainingtranscriptionregulator1,WWTR1)、含Discoidin、CUB和LCCL结构域蛋白2(Discoidin,CUBandLCCLdomaincontainingprotein2,DCBLD2)等，共1788个差异表达基因；24h组与对照组间上调表达的差异基因有：LCP1、补体C1s(complementC1s,C1S)、犬尿氨酸酶（kynureninase,KYNU）等，下调表达的差异基因有：磷酸丝氨酸转氨酶-1(phosphoserineaminotransferase1,PSAT1)、FARP1、FKBP型脯氨酰异构酶10(FKBPprolylisomerase10,FKBP10)等，共1832个差异表达基因；其中共同差异表达基因（commondifferentiallyexpressedgenes,cDEGs）有LCP1、KYNU、长链非编码RNA958(longintergenicnon-proteincodingRNA958,LINC00958)等1090个，差异均具有统计学意义。通过GO数据库分析，cDEGs主要富集到细菌对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞的顶端部分等；通过KEGG分析，cDEGs富集到的通路有白介素-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体通路等；从cDEGs中筛选肌球蛋白1B(myosin1B,MYO1B)在HOK与P.m共培养模型中进行验证，qRT-PCR及WesternBlot检测结果表明，MYO1B的表达在对照组和P.m刺激组之间存在显著性差异（P<0.001），且其表达随P.m刺激时间的延长及刺激浓度的增大而递增。结论P.m对口腔角质细胞的转录组存在重要影响。
关键词:口腔扁平菩藓;产黑普氏菌;转录组测序;肌球蛋白1B;上皮屏障功能;白介素-17信号通路,肿瘤坏死因子信号通路;TolI样受体通路;细胞顶
广东医学教育网指出，口腔扁平苔藓（orallichenplanus,OLP）是口腔黏膜病专科中最常见的疾病之一，最新研究表明整体发病率在0.89%左右。目前OLP发病机制尚不明确，普遍认为OLP是机体内在与外在因素联合作用引发的疾病。在一些外在因素（病原体、药物、牙科材料等）作用下，易感人群口腔黏膜病损部位的上皮细胞与抗原呈递细胞活化，这些细胞分泌多种炎症因子与趋化因子，激活T淋巴细胞，形成持续存在的免疫炎症反应。在OLP患者的唾液、组织及颊黏膜拭子中发现了菌群失调的现象，菌群失调可能在OLP发生发展过程中起到重要作用。本课题组前期研究发现，OLP组颊黏膜表面微生物菌落结构与健康对照组相比发生显著性改变，其中产黑普氏菌（Prevotellamelaninogenica,P.m）在OLP组颊黏膜表面构成比显著增加，且该菌能够侵入到OLP病损组织上皮层及固有层，并与巨噬细胞相互作用，提示P.m可能在OLP的发生发展中起到重要作用。而口腔黏膜上皮角质形成细胞作为抵抗外界入侵的第一道屏障，P.m与口腔上皮角质细胞的相互作用并不清楚。
转录组测序是对特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和进行高通量测序。通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。目前，对OLP转录组研究并不完善，多集中于OLP的癌变倾向、OLP的炎症反应过程等。有关口腔共生菌作用下，口腔上皮角质形成细胞转录组的改变目前尚无研究。因此本研究利用转录组测序技术，研究原代人口腔角质形成细胞（primaryhumanoralkeratinocytes,pHOKs）在P.m刺激下基因表达的改变，对差异表达基因（differentiallyexpressedgenes,DEGs）进行生物信息学分析，并筛选其中的差异基因进行验证，为探究DEGs所参与的通路与OLP的相关性提供实验基础。
1材料和方法
1.1主要材料和仪器
人口腔角质形成细胞系（humanoralkeratinocyte,HOK）由陈谦明教授惠赠。PrevotellamelaninogenicaATCC®25845TM(ATCC，美国），OKM培养基（Sciencell，美国），PBS（上海生工，中国），dispase酶（Sigma，美国），DMEM培养基（Hyclone，美国），胎牛血清（WISENT，美国），RNAisoPlus(TaKaRa，中国），无水乙醇（上海生工，中国），氯仿（国药，中国），异丙醇（国药，中国），PrimeScriptTMRTreagentKitPerfectRealTime(TaKaRa，中国），TBGreenPremixExTaq(TaKaRa，中国），BCAproteinassaykit(Solarbio，中国），MYO1B一抗（SantaCruz，美国），β-Tubulin一抗（ProteintechBiotechnology，中国），辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（碧云天，中国），超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天，中国），实时荧光定量PCR仪（ThermoFisher，美国），小型高速离心机（Eppendorf，美国），Bio-Rad电泳系统（Bio-Rad，美国），多功能酶标仪（Bio-Tek，美国）。
1.2样本的收集与处理
1.2.1pHOKs的分离与培养
本实验获得同济大学附属口腔医院伦理委员会的批准（伦理审批号：2018-002）。组织来源于同济大学附属口腔医院口腔颌面外科智齿拔除术时取下的颊黏膜组织，把组织放到含10%双抗PBS中清洗三遍。随后将组织放到0.25%中性蛋白酶（dispaseⅡ）中4℃过夜。第二天用无菌眼科镊分离组织上皮，PBS清洗2次，0.25%含EDTA的胰酶37℃震荡消化4min，用含10%FBS的DMEM培养基终止消化，离心，去上清，PBS清洗沉淀2次，用2mLOKM培养基重悬沉淀并铺板于六孔板，培养于37℃、5%体积分数CO2的细胞培养箱中。
1.2.2HOK细胞培养
HOK细胞以5×105个/mL的细胞密度接种于12孔板中，在添加了10%FBS的DMEM培养基中，37℃、5%体积分数CO2的细胞培养箱中培养，待镜下细胞密度达90%时用于实验。
1.2.3P.m菌株培养与菌液制备
冻存于-80℃的P.m菌液于37℃化冻，均匀涂于基础厌氧血平板，加厌氧袋置于密封袋，置于37℃孵箱复苏；3d后挑取平板上黑褐色菌点于新鲜液体厌氧培养基中，盖上并旋松管盖，加厌氧袋置于密封袋中，置于37℃摇床。1d后测菌液OD600=1，以4000rpm离心3min，弃上清，PBS清洗3次后，加1mLPBS重悬菌液，最终菌液浓度为1×109CFU/mL。
1.2.4菌液与细胞共同培养
(1)菌液与pHOKs共同培养：pHOKs培养到第三代后用于实验，吸去细胞上清液，PBS轻柔洗涤细胞3次，更换为不含血清的DMEM培养基，每孔加入10μL菌液，分别共培养4h和24h作为两实验组，以未与菌液共培养的pHOKs作为对照组，处理后的细胞于37℃、5%体积分数CO2的细胞培养箱中分别培养相应时长，随后提取细胞总RNA用于转录组测序。
(2)菌液与HOK细胞系共同培养：HOK细胞吸去细胞上清液，PBS轻柔洗涤细胞3次，更换为不含FBS的DMEM培养基。
为分别探究P.m对HOK细胞系在时间梯度和浓度梯度共培养后造成的影响，设置时间梯度共培养组和浓度梯度共培养组，以未与菌液共培养的HOK细胞作为对照组。时间梯度组每孔加入10μL菌液，各组共培养体系最终菌液浓度为5×106CFU/mL，分别培养4h、6h、8h；浓度梯度组每孔分别加入10μL、20μL、30μL菌液，各实验组体系中最终菌液浓度分别为：5×106CFU/mL、10×106CFU/mL、15×106CFU/mL，共培养4h。用DMEM培养基补足液体量，对照组只添加基础DMEM培养基，使各组共培养体系最终液体的量相同，总体积2mL，以便计算菌液浓度。将处理后的细胞在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，随后吸去上清，PBS轻柔洗细胞3次，待后续实验。
1.3CCK-8法检测细胞活性
通过CCK-8法检测P.m刺激后HOK细胞的活性。HOK细胞与P.m共培养。共培养完成后，轻柔吸去细胞上清液，PBS轻柔洗涤细胞3次，每孔加入100μLDMEM培养基和10μLCCK-8溶液，避光反应1h。随后在酶标仪450nm处测定细胞上清液吸光度，相对细胞活力计算方法：（实验组细胞吸光度/对照组细胞吸光度）×100%。
1.4总RNA的提取
将共培养完成后的细胞吸去上清，PBS轻柔洗涤3次，按试剂盒说明提取总RNA。测定RNA浓度。
1.5转录组测序
将样本送至上海晶能生物科技有限公司完成转录组测序。基本程序为：RNA片段化，逆转录成双链DNA，加工双链DNA末端，PCR扩增。PCR产物热变性形成单链，单链DNA环化得到单链环状DNA文库，DNA文库用IlluminaNova6000测序平台进行高通量转录组测序，获得高质量的转录组数据。
1.6测序结果的分析
对数据质量评估，对所获得的序列进行基因注释，用HTSeq软件计算各个基因的readscount。使用R语言limma包进行DEGs挑选。取log2（差异倍数）≥1且P≤0.05的基因筛选为具有统计学意义的DEGs。通过R软件的Pheatmap包对DEGs进行聚类分析，用GO数据库对DEGs进行生物学功能注释，用KEGGPathway数据库对DEGs进行通路的注释。利用R语言富集常用包clusterProfiler（版本3.18.0）对DEGs做GO、KEGGpathway的注释富集分析。对DEGs数量≥2，且统计P≤0.05的注释条目认为具有统计学意义。
1.7qRT-PCR验证差异表达基因
逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，再以实时荧光定量试剂盒进行实时荧光定量PCR。以GAPDH为内参。肌球蛋白1B(myosin1B,MYO1B）正义链：5’-GGAGACCATGGCCAAAATGG-3’,MYO1B反义链：5’-GGTCAAAGCGCTTCTTGAGG-3’;GAPDH正义链：5’-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3’,GAP-DH反义链：5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3’。
1.8WesternBlot验证差异表达基因
使用含1mmol/LPMSF的RIPA裂解液提取HOK细胞总蛋白，BCA试剂盒测蛋白浓度。7.5%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移至PVDF膜，封闭液室温下封闭1h，一抗孵育，4℃过夜，洗膜后加二抗，室温孵育1h，增强型化学法显色，ImageQuantLAS4000mini显影。
1.9统计学分析
应用GraphPadPrism8.0对数据进行统计学分析并绘制统计图。多组数据间比较采用单因素方差分析（one-wayanalysisofvariance,ANOVA），以Tukey进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1P.m对HOK细胞活力的影响
在倒置相差显微镜下可观察到完整的HOK单层细胞（图1a),HOK细胞与P.m共培养后，细胞密度降低，对培养皿底的黏附能力降低；部分细胞形态发生变化，由原本大而扁平的多角形形态转变为扁圆形或圆形，部分细胞的细胞核发生了核固缩，显示出空泡变性和细胞裂解，细胞边界不清晰（图1b,10μL菌液与HOK细胞共培养8h后镜）。
对共培养后HOK细胞的细胞活力检测结果（图1c、1d）表明，P.m会降低HOK细胞活力，在时间梯度组中，共培养4h后细胞活力降低到68.38%±12.30%(P<0.001），共培养6h后细胞活力降低至38.97%±1.05%(P<0.001），共培养8h后细胞活力降低至27.44%±0.30%(P<0.001）；在浓度梯度组中10μL组细胞活力下降至60.33%±3.93%(P<0.001),20μL组细胞活力下降至44.9%±2.77%(P<0.001),30μL组细胞活力下降至29.02%±2.46%(P<0.001）。
2.2P.m共培养后pHOK细胞差异表达基因及聚类分析
聚类分析结果显示，对照组与实验组的基因簇明显分开，提示对照组和实验组间在整体基因表达上存在明显差异（图2a）。在本次测序所获取的全部基因中，pHOK与P.m共培养4h组与对照组间有1788个基因的表达存在统计学差异，共培养24h组与对照组间有1832个基因的表达存在统计学差异。
pHOK与P.m共培养4h组相较对照组中表达上调基因为877个，表达下调基因为916个；共培养24h组相较对照组中表达上调基因为1012个，表达下调基因为828个，两处理组与对照组间有1090个共同差异表达基因（commondifferentiallyexpressedgenes,cDEGs）（图2b～2d）。
2.3P.m共培养后pHOK细胞差异表达基因GO富集分析
对各组上调的DEGs和下调的DEGs进行GO富集分析结果显示：(1)对照组与共培养4h组之间得到的上调DEGs富集于604个生物过程（biologicalprocess,BP）条目中，如细胞对脂多糖的反应（cellularresponsetolipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（responsetomoleculeofbacterialorigin）、生物刺激的细胞反应（cellularresponsetobioticstimulus）等；富集于12个细胞成分（cellularcomponent,CC）条目中，如细胞顶端部分（apicalpartofcell）、收缩纤维（contractilefiber）、肌节（sarcomere）等；富集于18个分子功能（molecularfunction,MF）条目中，如细胞因子活性（cytokineactivity）、受体配体活性（receptorligandactivity）、信号受体激活因子活性（signalingreceptoractivatoractivity）等。
(2)对照组与共培养4h组之间得到的下调DEGs富集于19个生物过程条目中，如上皮发育（epidemisdevelopment）、皮肤发育（skindevelopment）、上皮细胞分化调节（regulationofepithelialcelldifferentiation）等；富集于1个细胞成份条目中，即角质化包膜（cornifiedenvelope）。
(3)对照组与共培养24h组之间得到的上调DEGs富集的GO通路与4h组在分子功能富集条目相似度高。
(4)对照组与共培养24h组之间得到的下调DEGs富集于84个生物过程条目中，如化学突触传递的调节（modulationofchemicalsynaptictransmission）、跨突触信号的调节（regulationoftrans-synapticsignaling）、神经递质转运（neurotransmittertransport）等；富集于21个细胞成份条目中，如内质网腔（endoplasmicreticulumlumen）、神经元与神经元突触（neurontoneuronsynapse）、突触后密集区（postsynapticdensity）等；在MF条目中没有具有统计学差异的富集。
2.4P.m共培养后pHOK细胞差异表达基因KEGG通路富集分析
(1)对照组与共培养4h组之间得到的上调DEGs富集于33条KEGG通路中，显示其与细胞因子与细胞因子受体相互作用（cytokine-cytokinereceptorinteraction）、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体相互作用（viralproteininteractionwithcytokineandcytokinereceptor）、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）信号通路等相关。
(2)对照组与共培养4h组之间得到的下调DEGs在KEGG通路数据库中没有得到具有统计学差异的富集条目。
(3)对照组与共培养24h组之间得到的上调DEGs富集于12条KEGG通路中，显示其与白介素-17(interleukin-17,IL-17）信号通路、TNF信号通路、金黄色葡萄球菌感染（Staphylococcusaureusinfection）等相关。
(4)对照组与共培养24h组之间得到的下调DEGs在KEGG通路数据库中没有得到具有统计学差异的富集条目。
2.5差异表达基因肌球蛋白1B的验证
在本次转录组测序结果中，MYO1B是共培养4h组、共培养24h组共有的DEG。
将相同浓度（5×106CFU/mL）的P.m与HOK细胞共培养不同时长（0、4h、6h、8h),MYO1B的mRNA表达和蛋白表达在4、6、8h均显著增加，差异有统计学意义（P<0.005）。
将不同浓度的P.m(10μL组、20μL组、30μL组最终菌液浓度分别为：5×106CFU/mL、10×106CFU/mL、15×106CFU/mL）刺激HOK细胞4h后MYO1B的表达均显著增加，差异有统计学意义（P<0.005）。
3讨论
细菌微生物的菌群失调可能是OLP发生发展的原因之一。本课题组前期发现P.m在OLP患者颊黏膜表面构成比增加最为显著，而口腔上皮角质形成细胞作为口腔黏膜抵御外界入侵的第一道防线，可能直接受P.m刺激影响。在与P.m共培养后，HOK细胞在镜下可保持完整的细胞形态并形成完整的单层细胞，P.m的刺激会降低HOK细胞的活力，对HOK细胞造成损伤；在对OLP患者的口腔角质形成细胞进行体外分离培养后，发现较正常人群相比，OLP患者的口腔角质形成细胞的细胞活力明显降低，细胞形态也发生明显变化本课题组建立的P.m-HOK细胞共培养模型与之相似，推测P.m损伤HOK细胞可能与OLP临床中发生上皮层糜烂和溃疡有关。
目前认为免疫失调在OLP发病过程中起到重要作用，多个学者报道的OLP组织高通量测序结果显示其多富集在与免疫相关的GO与KEGG通路如趋化因子活跃、细胞因子活跃和原发性免疫缺陷等免疫炎症相关通路，以及与上皮发育分化、神经受体配体作用和代谢相关的通路如表皮分化复合体、激活神经元的受体配体交互和酪氨酸代谢等。有文献报道OLP组织中Toll样受体-4(tolllikereceptor-4,TLR-4）的明显高表达，且存在多种细胞因子表达改变，如肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）表达升高，白介素-23(interleukin-23,IL-23）和IL-17过表达等。为探究P.m对pHOK短时间作用及较长时间作用的影响，并探究P.m刺激与OLP发生发展之间的关联，本研究进一步将P.m与pHOK共培养后4h和24h进行转录组测序，研究结果显示，P.m刺激pHOK细胞后，炎症相关通路如IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体通路、细胞因子与细胞因子受体互作等在两处理组中均明显富集，其他KEGG通路如上皮发育、跨突触信号调节等也有较明显富集，而这些通路与既往报道的OLP转录组测序的富集通路有明显重合。
本研究结果显示，P.m与pHOK共培养4h组GO通路明显富集在细胞顶端部分（apicalpartofcell）和顶端质膜（apicalplasmamembrane）这两个细胞成分中。单个上皮细胞之间的空间密封由顶端连接复合物（apicaljunctionalcomplex）执行，其包含紧密连接、黏附连接和桥粒。细胞黏附建立后，紧密连接通过其蛋白质组分将空间密封起来。本课题组推测，在P.m刺激pHOK细胞早期，pHOK细胞的细胞顶端部分和顶端质膜的顶端连接复合物成分合成加强，以增强细胞间紧密连接，抵抗外界细菌侵入。
本研究结果显示，MYO1B是pHOK与P.m共培养4h、24h组均上调表达的差异基因。MYO1B即肌球蛋白1B，肌球蛋白是一种以ATP调节的方式结合到肌动蛋白的蛋白质，与肌动蛋白的结合促进肌球蛋白水解ATP，从而为肌动蛋白丝的运动提供动力。肌动-肌球蛋白的收缩是细胞骨架改变的形式之一，肌动蛋白-肌球蛋白环也是组成细胞紧密连接的重要部分，肌动蛋白-肌球蛋白环在维持上皮极性和上皮屏障功能中发挥了重要作用。Lv等报道，肌球蛋白ⅡA(myosin-ⅡA）调控缺氧低糖脑内皮细胞的紧密连接，抑制肌球蛋白ⅡA可减弱claudin-5和ZO-1等紧密连接蛋白的形态变化；Omelchenko等报道，在整体迁移的细胞中，肌球蛋白ⅨA(myosin-ⅨA）的敲除导致肌动蛋白细胞骨架的改变，细胞-细胞间黏附被破坏，导致细胞分散。以上这些实验表明，肌球蛋白家族通过细胞骨架与紧密连接调节了上皮细胞屏障。本研究结果显示，P.m浓度梯度对MYO1B表达的影响更为明显，提示菌群数量的失衡对紧密连接有较大影响。这与本课题组前期研究发现在OLP患者颊黏膜表面菌群失调相印证。此外，文献报道MYO1B参与了舌部鳞状细胞癌等多种肿瘤的发展与转移，且预示了较差的预后以及隐匿性淋巴结转移。提示MYO1B可能参与了OLP恶变。
综上，本研究对与P.m共培养4h和24h的pHOK细胞进行转录组测序，研究发现P.m和pHOK共培养过程中IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Toll样受体通路等KEGG通路明显富集，对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞顶端部分等GO通路明显富集，提示P.m对口腔角质细胞的转录组存在重要影响，其中MYO1B可能在细菌-细胞相互作用中发挥了重要作用。本研究为进一步揭示OLP的发病机制提供了相关的研究基础。
来源：广东医学教育网